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La secuenciación de genomas nos ha provisto de información acerca del mundo microbiano. La secuenciación de Sanger (1977) ha sido el método de secuenciación más usado. Sin embargo, éste posee limitaciones, entre las cuales se encuentran: necesidad de geles para electroforesis, análisis en paralelo de bajo número de muestras, difícil total automatización, alto costo, sensibilidad insuficiente para detección de mutaciones de bajo nivel y es incapaz de analizar eficientemente genomas diploides a un bajo costo. Además, es difícil el ensamblaje de genoma de novo. A raíz de ésto, han surgido alternativas a la secuenciación de Sanger, que son, la secuenciación por hibridación, por ligación y  la pirosecuenciación.

La pirosecuenciación, es la primera alternativa al método de Sanger convencional y se basa en la detección de pirofosfato durante la síntesis de ADN. Cuenta con ventajas de precisión, flexibilidad, procesamiento en paralelo y fácil automatización. Además, la técnica no tiene necesidad de utilizar primers y nucleótidos marcados, y de electroforesis en gel.

El método consta de la unión de hebras únicas de DNA a una esfera (una hebra por esfera), por medio de un adaptador, tras lo cual, son sometidas a clonamiento in vitro. Luego de que las esferas son cargadas, ocurre la adición de las enzimas DNA polimerasa, sulfurilasa, ATP luciferasa y apirasa, y de los sustratos APS y luciferin. A continuación, se agrega la solución de reacción, es decir, un dNTP a la vez, en ciclos. La cascada comienza con la liberación de pirofosfato, el cual es convertido a ATP a través de la enzima sulfurilasa en presencia de APS. El ATP generado, media en conjunto con la enzima luciferasa, la conversión a oxiluciferina, generando luz. La degradación de dNTPs no incorporados y de ATP se produce por la acción de la enzima apirasa. La luz emitida, es detectada por una cámara CCD y es observada como un pic en el pirograma, proporcional al número de nucleótidos incorporados. De manera que la secuencia de ADN, es demostrada mediante el pirograma.

Entre las ventajas de la pirosecuenciación, podemos decir, que es un método rápido y en tiempo real. Por otra parte, la secuenciación comienza con la primera base a un lado del primer, de tal modo, que el diseño del primer es más flexible. Otras ventajas, refieren la rapidez en la preparación de la muestra y los costos bajos de reactivos.

Las aplicaciones de la pirosecuenciación son variadas, ya que dicho método se ha estado utilizando en análisis de Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP), identificación de bacterias y tipificación de hongos y virus. La técnica, ha demostrado también, capacidad para realizar secuenciación de librerías de cDNA y de genomas completos.

A pesar de las ventajas y aplicaciones mencionadas anteriormente, la pirosecuenciación, presenta ciertas desventajas, tales como la secuenciación de tramos cortos de ADN y la dificultad para determinar el número de nucleótidos incorporados en regiones homopoliméricas que contienen más de 5-6 nucleótidos.

El método de pirosecuenciación, ha demostrado excelente precisión en análisis de fragmentos de DNA polimórficos. Esta tecnología, también se ha utilizado para cuantificación de frecuencias alélicas en poblaciones y ya compite con otros métodos de secuenciación, siendo relativamente nueva. En el futuro, se espera que alcance longitudes de lectura más largas, que reduzca el tiempo de secuenciación y que se realicen mejoras en la automatización.

Escrito por: Magdalena Valdivieso Cifuentes

Bibliografía:

-       Fakruddin and Abhijit Chowdhury.: “Pyrosecuencing-An Alternative to Traditional   Sanger Secuencing”, Institute of Food Science and Technology (IFST), Bangladesh Council of Scientific and Industrial Research (BCSIR), Dhaka, Bangladesh 2012.

-       Espinoza, K.: “Sesión: Secuenciación y Microarrays” [apuntes/redacción] 2013. Universidad del Desarrollo, Tecnología Médica. Biología Molecular diagnóstica.


 





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